② 摇瓶种子培养 生产斜面的菌落接种到摇 瓶培养基中，得到摇瓶种子。摇瓶种子 （母瓶）可以直接接种种子罐，也可以扩 大培养，用所得子瓶接种。发酵单位、菌 丝阶段、菌丝粘度或浓度、糖代谢、种子 液色泽和无菌检查为评价摇瓶种子的重要 指标，且冷藏时间不能超过7天。 培养基的成分：黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸 铵、硫酸钙。

　　• • • • （1）菌种 点青霉菌：生产能力很低，不能满足工业生产要求。 产黄青霉菌：生产能力大为上升。 MinnR-B和NRRL1951的生产能力分别为120U/mL和 100U/mL，后者经诱变处理的变种，生产能力可达1000～ 1500U/mL。但该系菌株可分泌黄色素，影响了成品质量。 • 变种51-20：不产色素变种51-20，其生产能力可达66000～ 70000U/mL。 • 菌株WisQ176：全世界用于生产青霉素的高产菌株，其发酵 生产水平已达85000U／mL以上。 • 菌种保藏：真空冷冻干燥状态下保存分生孢子；也可用甘油 或乳糖溶剂作悬浮剂，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子悬浮液 和营养菌丝体；还可用砂土管保藏。

　　• 掌握抗生素、氨基酸、蛋白质、核酸、维生素和辅酶、酶类、 甾体、细胞生长调节因子与组织制剂的生产工艺、提取和精 制工艺；掌握糖类药物分离纯化的手段和制备工艺相关技术； 掌握脂类药物基本知识和其分离纯化的手段和制备工艺相关 技术；掌握生物制品的分类、一般制造方法及典型生产工艺 过程。 • 熟悉抗生素类药物、氨基酸类药物、蛋白质类药物、核酸类 药物、维生素及辅酶类药物酶类药物、甾体药物、细胞生长 调节因子与组织制剂的通用生产工艺；熟悉氨基酸类药物常 用提取方法；熟悉干扰素的生产工艺；熟悉维生素的提取工 艺；熟悉生物制品的来源及应用。 • 了解抗生素药物、胱氨酸、赖氨酸、维生素及辅酶类药物的 结构和理化性质；了解核酸类药物的基本概念；了解酶类药 物、甾体药物、细胞生长调节因子与组织制剂的生产步骤； 了解几种糖类药物、脂类药物的制备；了解常用的生物制品 的种类及生物制品的发展前景。

　　存在，可用离子交换法提取。 • 在空气或日光中稳定。 • 易溶于水，不溶于甲醇、氯仿和丙酮，硫酸盐难溶于甲醇。

　　• 青霉素常采用三级发酵。 • 一级种子发酵：米胞子进入发芽罐，培养基上的孢子萌发， 形成菌丝。接种到以葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米浆、碳酸 钙、玉米油、消泡剂等为培养基的一级种子罐内。发酵周 期为40～50h，温度27±1℃。通无菌空气，空气流量 1:3m3/(m3•min)，搅拌转速为300～350r/min。

　　• 熟练掌握抗生素、氨基酸、蛋白质、核酸、酶类、糖类、 脂类、甾体激素、维生素和辅酶类、生物制品、细胞生长 调节因子类药物的生产工艺，学会控制工艺要点，具备从 事生物制药生产及相关工作的能力，能够理论联系实际， 分析和解决实际问题的能力。 • 学会根据药物的理化性质、药物来源、菌种，设计生产工 艺。 • 针对目标体系，熟练选择合适的分离体系对目标产品进行 分离。 • 针对目标体系，熟练选择合适的分离技术和制备工艺。

　　• 一、抗生素工业生产及工艺 • 抗生素生产方法：生物合成法、全化学合成法 半合成法

　　• 生物合成法也称为微生物发酵法。它将产 生菌接种到培养基上，在一定的条件(培养 基、温度、pH、通气、搅拌等)下培养、繁 殖，产生抗生素。然后采用适宜的方法将 抗生素从发酵液中分离出来。

　　发酵稳定期，湿菌占15～20%，丝状菌干重3%， 球状菌干重5%。中后期每天放一次，每次放掉 总发酵液的10%

　　• ③种子罐扩大培养 种子罐可分为2～3级， 用来扩大种子接种量。由于1级种子罐的接 种量较小，因此培养液的体积有所限制。 而对于2级种子罐，接种量为10%，到了最 后，接种到发酵罐的接种量在20%左右。

　　• ④发酵培养 • a. 培养基 发酵培养基的成分为葡萄糖、黄豆饼 粉、硫酸胺、磷酸二氢钾、磷酸钙、玉米浆等。 葡萄糖总量一般在10%左右，磷酸盐浓度为 46.5～465mg/L，Fe2浓度不能超过60μg/L。 • b. pH值 菌丝生长的pH值为6.5～7.0，生物合成 最适pH为6.8～7.3。 • c. 温度 灰色链霉菌发酵温度在28.5℃左右最适 宜。 • d. 溶氧 灰色链霉素是一种高度好气菌，在黄豆 粉培养基内，增加通气量能提高发酵单位。同时 增加通气量也能升高pH值。 • e. 补料 放罐时控制葡萄糖的浓度低于1%，以利 于后续提取。 • f. 消泡 在发酵过程中泡沫较多，需补入消泡剂。

　　① 发酵液的过滤与预处理 工业上采用草酸调节发酵液的pH 至2.8～3.2，同时蒸汽加热到70～75℃维持2min，使蛋白质凝 固，提高过滤速度。草酸酸化还可除去Ca2。酸化液过滤后用 NaOH调pH到6.7～7.2可得到原滤液。原滤液链霉素浓度在 5000U/ml左右。原滤液中Mg2，可以加入三聚磷酸钠去除。 • ② 吸附与洗脱 生产上主要使用羧酸树脂的钠型，提取链霉素 后容易洗脱。流出液中的单位在100U/mL以下。国内生产一般 应用弱酸110×3或101×4树脂，而在国外广泛使用一种大网 络羧酸阳离子交换树脂Amber lite IRC-50。 • ③ 精制 洗脱液中含有较多的杂质，链霉素含量只有75%～ 90%。可以采用高交联度的氢型磺酸树脂，除去洗脱液和工业 硫酸带入的金属离子和阳离子化的有机分子杂质。酸性精制液 用羟型阴离子交换树脂中和酸，最后得到链霉素精制液。精制 液以活性炭脱色，脱色后以Ca(OH)2调pH至5.5～6.0，过滤后， 进行真空薄膜蒸发浓缩。所得浓缩液仍有色素、热原等杂质， 需进行第二次脱色，改善成品色泽和稳定性。成品浓缩，无菌 过滤后喷雾干燥可得成品。链霉素的总收率为72％左右。

　　青霉素作用机理： （1）作用于核糖核蛋白体的50S亚基，通过竞争细菌的粘 肽合成酶，即青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），抑制细胞壁的粘肽合成，造成细菌细 胞壁缺损，大量的水分涌进细菌体内，使细菌肿胀、破裂、 死亡； （2）促发自溶酶活性，使细菌溶解。

　　• 二级发酵罐：按10%接种量移种到培养基成分为玉米浆、 葡萄糖、玉米油、消泡剂等的二级种子罐内。通风比为(1: (1～5) m3/(m3•min) ，搅拌转速为250～280r/min，天选温度 25±1℃；发酵周期为13～14h。

　　• 二级种子达到要求后，可进入生产罐，培养基成分为 花生饼粉(高温)、麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素， 硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰 胺及消泡剂，CaCO3等。接种量在20%，通气比控制 在 1: (0.8 ～ 1.2)m3/(m3· min) ， 搅 拌 转 速 为 150 ～ 200r/min，罐压控制0.04～0.05 MPa，于25～26 ℃ 下培养，发酵周期在 200h 左右。前 60h pH 为 6.8 ～ 7.2，而后pH稳定在6.5左右；前60h温度为26℃，以 后为24℃。

　　最为严重的为过敏性休克，死亡率高达10%。青霉素本身并 不是过敏原。青霉素分子在pH7.5水溶液中很快重新排列成青 霉烯酸，进而分解为青霉噻唑酸。青霉噻唑酸可与人体组织 内的γ-球蛋白和白蛋白结合成青霉噻唑蛋白，青霉噻唑蛋白 即为引起青霉素过敏反应的主要致敏物质。

　　(二)链霉素 • 链霉素又称链霉素A，属氨基糖苷类抗生素， 分子式为C21H39N7O12，由链霉胍、链霉糖 和N-甲基-L-葡萄糖胺三个部分以苷键结合 而成的糖苷。

　　• 硫酸链霉素为无臭或微臭的白色或类白色粉末，有引湿性。 • 分子中有三个碱性基团，在中性溶液中以三价阳离子形式

　　• 青霉素在水中的溶解度很小，易溶于有机溶 剂如氯仿、笨、醋酸乙酯等。而其钠、钾盐 则易溶于水和甲醇。青霉素在水中的pK值为 2.7，在低pH（﹤4）条件下，霉素分子中的 羧酸不解离，此时，青霉素易溶于有机溶剂 而难溶于水；在高pH（﹥5）条件下，羧基 发生酸式解离，此时青霉素易溶于水，难溶 于有机溶剂。可利用此性质进行萃取与反萃 取，精制青霉素。

　　• 将砂土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨 组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。 最适生长温度在25～26 ℃，培养6～8天， 得单菌落，再传斜面，培养7d，得斜面孢 子。再移植到优质小米或大米固体培养基 上，25℃，相对湿度45%～50%,生长7d， 制得小米孢子。孢子成熟后进行真空干燥， 低温保存备用。

　　是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青 霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的 繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。

　　1877年，法国微生物家巴斯德发现霉菌会抑制尿液中的炭疽杆菌的生长。 1920年，比利时人安德烈· 格拉提亚和莎拉· 达斯在发表论文说感染了青霉的 葡萄球菌培养基中，葡萄球菌的生长被抑制了。

　　前期，间歇搅拌且不多加油脂；中期可加油控制， 必要时降低空气流量，但搅拌应充足；后期尽量 少加消泡剂

　　1928年夏弗莱明发现青霉素，1929年在《英国实验病理学杂志》上报道。

　　1939年弗莱明将点青霉菌菌种提供给澳大利亚病理学家弗洛里和生物化学 家钱恩。他们用冷冻干燥法提取了青霉素晶体。 1940年弗洛里和钱恩证实了青霉素对链球菌、白喉杆菌等细菌感染的疗效。 1942年美国制药企业开始大批量生产青霉素。 1943年，制药公司已经发现了批量生产青霉素的方法。 1944年，药物供应足够治疗第二次世界大战期间所有参战的盟军士兵。 1945年，弗莱明、弗洛里和钱恩分享诺贝尔生理学或医学奖。 1953年5月，中国第一批国产青霉素诞生。 2001年年底，我国青霉素年产量已占世界年总产量的60％，居世界首位。

　　①斜面孢子培养 将保藏在低温(0～2℃)的砂土管 中的菌种接种到斜面培养基上，接种后于27℃下 培养6～7d，得到原始斜面，而后由原始斜面的 丰满单菌落接种到子斜面上得到生产斜面，27℃ 下培养6～7d。经两次传代后，可纯化菌株。生 产斜面菌落为白色丰满梅花或馒头型，背面有淡 棕色色素。合格的孢子斜面保存在冰箱(0～4℃) 内。 培养基的成分：葡萄糖、蛋白胨、氯化钠和豌豆 浸液等。天选团队